Международный журнал сердечно-сосудистых исследований

Использование Na3PO4 для улучшения in vitro моделей кальцификации аортального клапана у животных

Дэниел Алехандро Лерман, Саи Прасад и Насри Алотти

Использование Na ₃ PO ₄ для улучшения in vitro моделей кальцификации аортального клапана у животных

Предыстория/Цели: Патогенез кальцифицирующей болезни аортального клапана (CAVD) включает активный воспалительный процесс интерстициальных клеток клапана (VIC), характеризующийся активацией специфических остеогенных сигнальных путей и апоптозом. Этот процесс можно изучить, проанализировав определенные молекулярные маркеры и пути экспрессии генов спонтанной кальцификации. Целью нашего исследования является изучение роли фосфата натрия (Na ₃ PO ₄ ) как промотора кальцификации с целью улучшения моделей животных in vitro для тестирования потенциальных ингибиторов кальцификации.

Материалы и методы: VIC были извлечены из 6 здоровых 6-месячных свежих свиных сердец путем серийного переваривания коллагеназой. Количественная полимеразная цепная реакция (qPCR) использовалась для количественной оценки трансдифференциации интересующих генов во время спонтанной кальцификации VIC. Спонтанная кальцификация VIC была увеличена путем добавления Na ₃ PO ₄ (3 мМ, pH 7,4). Степень кальцификации оценивалась путем окрашивания ализарином красным для отложения кальция и окрашивания сириусом красным для коллагена. Колориметрические методы использовались для количественного определения отложения кальция и коллагена. Кроме того, ферментативная активность щелочной фосфатазы (ALP) измерялась с помощью кинетического анализа. Для статистического анализа мы использовали SPSS и Microsoft Office Excel 2013.

Результаты: Свиные VIC кальцифицируются спонтанно с демонстрируемым отложением кальция и коллагена. В этом исследовании мы наблюдали увеличение отложения кальция и коллагена с 0 по 14 день (кальций: 376%; P<0,001, коллаген: 3553%; P<0,001). Анализ мРНК методом ПЦР к 14 дню показал следующие результаты: α-актин, маркер фенотипа миобластов, увеличился в 1,6 раза; P<0,001. Runx2, маркер остеобластов, увеличился в 1,3 раза; P<0,05, TGF-β, промотор остеогенеза, увеличился в 3,2 раза; P<0,001, и RhoA, регулятор образования узелков в миобластах, увеличился в 4,5 раза; P<0,001 по сравнению с их уровнями в день 0. RANKL мРНК и кальпонин существенно не изменились. Обработка свиных VIC Na ₃ PO ₄ (3 мМ, pH 7,4) привела к заметному увеличению отложения кальция к 14 дню (522%; P<0,001) и значительному увеличению активности ALP к 7 дню (228%; P<0,05). Значительных изменений активности ALP между группами к 14 дню не наблюдалось.

Заключение: Это исследование продемонстрировало повышение регуляции некоторых специфических молекул во время спонтанной кальцификации аортальных VIC с активным увеличением активности кальция, коллагена и ЩФ. В этой модели in vitro было возможно увеличить спонтанную кальцификацию VIC с Na ₃ PO ₄ (3 мМ, pH 7,4) до уровня, на котором ингибиторы кальцификации могли быть протестированы для выявления новой потенциальной терапевтической стратегии против кальцифицирующего аортального стеноза.